国槐(Sophora japonica L.)是蝶形花科(Papilionoideae)槐属(Sophora)植物，又叫槐树、巨槐、细叶槐、中国槐、槐米树、守宫槐等，是我国特有的集材用、药用、食用、观赏于一体的树种，在园林绿化中占有重要地位(火树华, 1990, 中国林业出版社, 221-224)。目前，有关国槐繁殖技术(袁秀云等, 2007)和遗传转化方面的研究比较多(张晓英等, 2009)，国槐种子不同性状的表型变异及规律研究也有报道(孙荣喜, 2011)，但是，国槐分子技术应用上比较薄弱，因此，开展新型标记研究古国槐遗传多样性，为国槐遗传资源评价、保存和利用提供依据，对促进古国槐分子育种进程具有重要意义。

相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是新型的PCR分子标记技术，于2001年由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士在芸苔属植物上开发而来(Li and Qurios, 2001)，该标记多态性高、重复性好、在基因组中分布均匀、引物通用性强等(柳李旺等, 2004, 南京农业大学学报, 26(5): 777-781)；SRAP正反相引物可以两两随机搭配组对，用少数引物得到多对引物组合，这样使得引物的使用效率提高了，引物的合成成本也降低了。目前该标记已被成功应用于遗传图谱构建(林忠旭等, 2003, 科学通报, 48(15): 1676-1679）、杂种纯度鉴定(文雁成等, 2006）、遗传多样性分析(陈伦林等, 2008）等方面研究工作。

利用SRAP分子标记进行遗传多样性分析时，PCR体系非常重要，何正文等(1998)较早提出了正交设计优化PCR体系的方法，该方法综合考查了PCR反应体系中各因素及其互作影响，较快得到理想的试验结果，提高效率。本实验采用L₁₆(4⁵)正交设计和单因子相结合的试验，从Mg²⁺浓度、DNA模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度、ExTaq酶浓度以及退火温度等几个方面进行国槐SRAP-PCR主要反应条件的探讨，最后确立最优反应系统，为今后进行古国槐遗传多样性分析及育种工作奠定良好的基础。

1结果与分析
1.1 SRAP-PCR正交实验结果分析
国槐L₁₆(4⁵)正交因素水平反应见表2，电泳实验结果如图1。根据遗传多样性分析要求,对PCR扩增结果依据电泳谱带的强弱及多少，从高到低依次打分，将16个处理结果划分为16个评分等级以便统计分析(何正文等, 1998)。这种打分的方法，主观性比较强，为了使结果更客观，我们根据扩增条带数量丰富、清晰度高、背景低、特异性条带和非特异性条带之间的差异明显的处理，同时参考条带亮度和背景清晰程度为每个处理赋值，进行数据分析。实验重复两次，16个处理赋值数分别为1, 5, 10, 7, 8, 4, 9, 3, 16, 11, 15, 12, 14, 13, 2, 6和3, 5, 8, 9, 12, 11, 13, 2, 16, 15, 14, 10, 6, 7, 1, 4。将上述两次16个处理的评分结果用SPSSV18.0进行方差分析，分析结果见表1。F值反映了各因素对PCR体系显著性影响情况，影响随F值的增大而增大，反之越小，由表1知，正交设计各因素反应水平对反应体系的影响为ExTaq酶>引物>DNA模版>Mg²⁺>dNTPs。

图1 SRAP-PCR正交实验设计PCR电泳 Figure 1 Electrophoresis result of SRAP-PCR by orthoronal design

 

表1 SRAP-PCR反应各因素间方差分析表 Table 1 Variance analysis for the factors of SRAP-PCR reaction

1.2单因子试验结果分析
1.2.1 Mg²⁺浓度对PCR扩增效果的影响
Mg²⁺浓度较高时可以增加产量，但也会降低反应的忠实性，还会影响ExTaqDNA聚合酶的活性，直接影响产量(陈万胜等, 2008; 王燕青和季孔庶, 2009)。Mg²⁺能与反应液中的引物、模板及dNTPs相结合，使引物与模板的结合效率受到影响，还影响产物特异性及形成引物二聚体等(孟宪婷等, 2009)，试验选取了(0.2 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L)浓度的Mg²⁺进行了PCR扩增，结果显示：Mg²⁺为2.0 mmol/L时扩增条带清晰，且出现了特异性条带，当浓度过高时，谱带又变弱，最终确定Mg²⁺浓度为2.0 mmol/L，如图2中5泳道。

图2 不同Mg2+浓度的SRAP反应结果 Figure 2 The SRAP profile with different Mg2+ concentrations

1.2.2 DNA浓度对PCR扩增效果的影响
DNA模板的浓度和质量，是PCR成败的关键因素之一，太少时没有扩增条带，太多时则会出现非特异性条带（彭飒等, 2006, 第二军医大学学报, 27(5): 544-547）。试验选用不同DNA模板浓度(40 ng, 60 ng, 80 ng, 100 ng, 120 ng, 140 ng)进行扩增，结果显示：DNA模版在80~120 ng之间没有明显的差异，考虑经济因素，确定80 ng模板量为宜，如图3中3泳道。

图3不同DNA浓度的SRAP反应结果 Figure 3 The SRAP profile with different DNA concentrations

1.2.3 dNTPs浓度对PCR扩增效果的影响
dNTPs与扩增效率密切相关，过高时与ExTaqDNA酶竞争Mg²⁺，过低时会使扩增产物单链化，两者都对扩增不利(孟宪婷等, 2009)。试验选取(1 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L, 3.0 mmol/L, 3.5 mmol/L)的dNTPs浓度进行扩增，结果显示：1.5 mmol/L、0.20 mmol/L浓度时效果较好，综合考虑，确定dNTPs最适浓度为2.0 mmol/L，如图4中3泳道。
 

图4 不同dNTPs浓度的SRAP反应结果 Figure 4 The SRAP profile with different dNTPs concentrations

1.2.4引物浓度对PCR扩增效果的影响
引物浓度能够影响扩增特异性，过高会加剧非特异性扩增和错配的发生；引物浓度过低会使PCR扩增效率降低(任羽等, 2004)，所以选择合适的引物浓度很重要。试验选取(0.4 μmol/L, 0.6 μmol/L, 0.8 μmol/L, 1 μmol/L, 1.2 μmol/L, 1.4 μmol/L)的引物浓度，研究结果显示：伴随引物浓度不断加大，扩增的条带变得逐渐清晰、丰富，过高时条带又变弱，在0.6 μmol/L时出现特异性条带，在0.6-0.8 μmol/L之间没有差异，最终确定引物浓度为0.6 μmol/L，如图5中2泳道。

图5不同引物浓度的SRAP反应结果 Figure 5 The SRAP profile with different primer concentrations

1.2.5 ExTaq酶浓度对PCR扩增效果的影响
酶用量是PCR重要影响因素之一，ExTaqDNA聚合酶浓度过低时无扩增，浓度过高又会引起非特异性扩增。实验设置6个ExTaq酶浓度(0.25 U, 0.5 U, 0.75 U, 1.0 U, 1.25 U, 1.5 U)，结果显示：酶浓度在0.75 U、1.0 U时扩增条带较多，用量为1.25 U时，产物条带出现扩散，综合考虑，ExTaq酶浓度确定为0.75 U，如图6中3泳道。

图6不同Extaq酶浓度的SRAP反应结果 Figure 6 The SRAP profile with different Extaq DNA polymorases concentrations

1.2.6退火温度对PCR扩增效果的影响
退火温度是影响PCR特异性的重要因素，根据引物的长短、碱基和浓度而定。较低的退火温度可以使引物与模板发生结合，但易产生非特异性条带；过高又抑制引物与模板的结合。试验在PCR仪自动生成的温度梯度中选择6个温度扩增(48.1℃, 49.4℃, 50.7℃, 52.6℃, 54.1℃, 55.5℃)，结果表明：温度为48℃或高于55℃时，PCR产物量较低，条带亮度弱，而在50℃和52℃温度时扩增稳定。因此，确定退火温度为50℃如图7中3泳道。

图7不同退火温度SRAP反应结果 Figure 7 The SRAP profile with different annealing temperature concentrations

1.3优化反应体系的验证
使用初步筛选的引物组合Me11/Em5，对16份不同种源的国槐进行扩增，验证上述优化体系，结果显示(图8)，每份样品均扩增出DNA片段，条带清晰，说明该体系稳定，适合国槐SRAP-PCR反应。

图8 引物ME11-EM5对国槐16个样品的SRAP扩增电泳结果 Figure 8 SRAP profiles amplified among 16 grape cultivars with primer pair M11-E5

2结论与讨论
SRAP被成功应用于多种植物的遗传多样性分析、相关基因克隆、遗传图谱构建以及重要的性状标记等，如红松(Chen et al., 2010)、柿树(Guo and Luo, 2006)甜瓜(王建设等, 2007)等，基于PCR反应的SRAP标记，反应体系中任何一种因素的改变都会影响扩增结果的变化，各组分间相互作用的浓度较难确定。本实验采用单因素完全设计和正交实验设计相结合的方法，共同探讨了国槐SRAP-PCR中各影响因子的规律及最佳浓度范围，正交实验结果显示以9泳道最佳(图1)，其主要反应因素浓度为：Mg²⁺ 1.5 mmol/L，DNA 80 ng，dNTPs 2.5 mmol/L，引物0.8 μmol/L，ExTaqDNA 1.0 U，单因子实验结果显示：Mg²⁺ 1.5 mmol/L，DNA 80 ng，dNTPs 2.5 mmol/L，引物0.8 μmol/L，ExTaqDNA 0.75 U。这两种实验结果都表明DNA 80 ng，dNTPs 2.5 mmol/L时最佳。通过多次多水平实验证明，Mg²⁺浓度2.0 mmol/L，引物0.6 μmol/L，ExTaqDNA聚合酶0.75 U时，此反应体系扩增条带更清晰，重复性和稳定性较好，所以，最终建立的SRAP体系(20 μL)为：Mg²⁺浓度2.0 mmol/L，模板DNA 80 ng，dNTPs 2.5 mmol/L，引物0.6 μmol/L，ExTaqDNA聚合酶1.0 U，10×PCR Buffer 2.5 mmol/L；退火温度为50℃时最佳。利用该体系进一步进行国槐遗传多样性分析，对不同地理种源的国槐进行遗传分化度和亲缘关系的研究，为国槐分子辅助育种，种质资源的保存和利用提供一定的理论基础。

3材料与方法
3.1材料与试剂
供试材料分别来自山东潍坊、淄博、滨州、泰安、东营等地的野生古国槐资源，由2012年3根据山东省古树索引资料，搜集到古国槐无性系，嫁接于山东省林业科学研究院苗圃基地。整个实验以古国槐无性系叶片为材料。
试验所用ExTaqDNA聚合酶，Mg^2＋，10×PCR Buffer，dNTPs等试剂均购自大连TaKaRa公司；SRAP引物采用的组合参考文献(Li and Qurios, 2001; Ferriol et al., 2003)，由上海博尚生物工程技术有限公司合成。

3.2实验方法
3.2.1 DNA提取与检测
采用改良CTAB法提取样品材料中的DNA (Fjellstrom et al., 1994)。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳对提取样品DNA进行初步检测后，在紫外分光光度计下对其浓度和纯度进行定量检测，并将DNA稀释到约50 ng/μL，于-20℃条件下保存。

3.2.2 PCR反应程序的确定
参考文献(Li and Qurios, 2001)的扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min-35℃退火1 min-72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min-50℃退火1 min-72℃延伸1 min，进行35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

3.2.3 PCR反应因素水平的确定
为了确立SRAP反应体系(20 μL)中主要因素：ExTaq酶、引物、DNA模版、Mg²⁺和dNTPs。的最佳水平，该实验采用L₁₆(4⁵)正交设计和单因子设计相结合的方法，各因素水平见表2。引物对序列为ME11：TGAGTCCAAACCGGATA，EM5：TGAGTCCTTTCCGGTAA。

表2 SRAP-PCR反应因素水平 Table 2 factors levels of PCR reaction

3.2.4 SRAP优化体系的验证
利用优化好的SRAP体系，多不同国槐样品进行扩增，引物组合同上(3.2.3)，PCR产物用含EB 0.5 mg/L琼脂糖凝胶(1.5%)电泳检测紫外光下GeneGenius观察成像。

作者贡献
宋伟栓是本研究的实验设计和实验研究的执行人；庞彩红、李双云及李丽完成数据分析；杨克强参与实验设计，试验结果分析；夏阳是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由山东省农业生物资源创新利用研究课题(2001157)资助。

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